NIPT baseado em células fetais por PCR digital em gotas é desenvolvido em estudo piloto japonês

Pesquisadores no Japão mostraram que podem analisar características genéticas de células fetais circulantes no sangue materno sem a necessidade de isolá-las ou amplificar seus genomas, potencialmente abrindo a porta para testes de diagnóstico pré-natal não invasivos baseados em células fetais.

A tecnologia, descrita em um artigo no Journal of Molecular Diagnostics, usa PCR digital em gotas (ddPCR) single-cell (sc-ddPCR) para analisar as populações de células do sangue materno que foram enriquecidas para células fetais por cell-sorting magnético (MACS).

Em seu artigo, os cientistas, liderados por Kenichiro Hata , chairman da biologia materno-fetal do Instituto Nacional de Pesquisa para Saúde e Desenvolvimento Infantil em Tóquio, demonstrou que eles foram capazes de detectar SRY, um gene no cromossomo Y, em células individuais de amostras de sangue de três mulheres grávidas portadoras de um feto masculino, mas não em amostras de 10 mulheres carregando um feto feminino. Todas as mulheres estavam no segundo ou terceiro trimestre de gravidez.

Eles escrevem:

“No futuro, ao otimizar a classificação e o encapsulamento de células, bem como gerar um ambiente de PCR mais eficaz em cada gota, este sistema sc-ddPCR modificado pode ser um método de análise inovador que pode ser aplicado a vários campos de pesquisa e, possivelmente, ao diagnóstico clínico testando”

A maioria dos testes de DNA pré-natal não invasivos hoje analisam o DNA fetal livre de células, que é misturado com grandes quantidades de DNA livre de células maternas no sangue da mãe. No entanto, sabe-se há muito tempo que um número muito pequeno de células fetais ou placentárias – estimado em menos de 10 por mililitro – circula no sangue das mulheres grávidas. Ser capaz de analisar seu material genético separadamente, sem o histórico de DNA materno, poderia produzir resultados mais precisos para todo o genoma. No entanto, provou-se extremamente difícil selecionar e isolar células de origem fetal dentre milhões de células maternas em cada mililitro de sangue.

“O NIPT baseado em células seria um verdadeiro divisor de águas para o diagnóstico pré-natal, pois permitiria que o teste se tornasse diagnóstico em vez de um método de triagem”, disse Lisa Jensen-Long, vice-presidente de marketing do grupo de biologia digital da Bio-Rad Laboratories, em um e-mail. Jensen-Long não esteve envolvida no estudo, mas a tecnologia de PCR digital de gotas usada no estudo é comercializada pela Bio-Rad.

Pesquisadores fizeram progressos na obtenção dessas células fetais. Em um estudo publicado em dezembro , por exemplo, uma equipe do Baylor College of Medicine da Columbia University mostrou que é possível detectar e isolar trofoblastos, que se originam da placenta, no sangue de quase todas as ~100 gestantes, e sequenciar seus DNA após a amplificação do genoma completo. Um um desdobramento da Baylor College , Luna Genetics, agora planeja desenvolver testes clínicos para analisar células fetais no sangue materno para condições genéticas graves.

Para seu próprio estudo, os pesquisadores japoneses apostaram em detectar características genéticas em células fetais sem isolá-las completamente das demais células sanguíneas, o que geralmente exige que as células sejam coradas ou fixadas. Em vez disso, eles enriqueceram grosseiramente as células fetais por MACS, coletando apenas as células que não expressam CD45 ou CD14, o que inclui células fetais.

Eles então analisaram o DNA de células individuais, sem amplificá-lo, usando o sistema QX200 ddPCR da Bio-Rad, que eles haviam empregado anteriormente para um tipo diferente de análise de célula única. Especificamente, eles usaram uma sonda de referência, RPP30, e uma sonda específica do cromossomo Y para o gene SRY. Uma vantagem de usar esse sistema, eles escreveram, é que ele pode analisar até 3.000 células individuais por poço.

Um problema que eles encontraram foi que as populações de células grosseiramente purificadas que analisaram continham alguns contaminantes. Diminuir a quantidade de polimerase na reação de PCR, eles descobriram, aumentou o sinal obtido de ambas as sondas juntas, aumentando assim a sensibilidade de seu ensaio.

Quando eles aplicaram seu teste a frações celulares de 13 amostras de sangue periférico materno, descobriram que ele indicou corretamente apenas as três amostras de mulheres com fetos masculinos como SRY-positivas e todas as 10 amostras de mulheres com fetos femininos como SRY-negativas.

A esperança é que outros genes possam ser detectados em células fetais de maneira semelhante por essa abordagem. “Além disso, não apenas o número de cópias, mas também as alterações de nucleotídeo único podem ser avaliadas tecnicamente em um nível de célula única com este sistema sc-ddPCR”, escreveram os pesquisadores.

Enquanto o estudo japonês está mostrando a prova de conceito para NIPT baseado em células fetais, “mais trabalho é necessário para otimização e confirmação com controles adequados, juntamente com um conjunto de dados mais amplo”, disse Jensen-Long. “Também vale a pena notar que a análise fetal unicelular exigiria a capacidade de avaliar o número de cópias por célula”, acrescentou, enquanto a abordagem detalhada no estudo apenas determina se as células possuem ou não um DNA específico. alvo.

“O sistema Bio-Rad QX200 é ideal para realizar análises de célula única (single-cell), e esta é uma das publicações que demonstram como células individuais podem ser contadas usando a tecnologia de PCR digital”, disse ela, acrescentando que a própria Bio-Rad está desenvolvendo soluções em NGS e ddPCR para o mercado de terapia genética de célula única.

“A principal limitação dessa abordagem é que apenas um ou alguns loci genômicos podem ser examinados de cada vez”, disse Arthur Beaudet, CEO da Luna Genetics e ex-presidente de genética molecular e humana do Baylor College of Medicine, em um e-mail. Embora possa ser usado para detectar distúrbios monogênicos em gestações com risco conhecido para tal condição, “não seria adequado para análise do número de cópias em todo o genoma”, disse ele.

Ele também destacou que as amostras analisadas pela equipe japonesa foram coletadas no final da gravidez. “Não está claro se há células fetais suficientes no início da gravidez para ter sucesso com essa abordagem”, disse ele. Além disso, ele observou que o exato tipo de célula analisada usando este método não é determinada.

Enquanto isso, outros têm buscado abordagens baseadas em PCR digital para testes pré-natais não invasivos. Por exemplo, a BioCore da Coréia em 2018 lançou um teste para trissomia fetal 21 que é analisado no QX200. No entanto, esse teste analisa o DNA livre de células, não o DNA de células únicas.

Além disso, a Bio-Rad informou em 2019 que estava observando oportunidades para seu sistema QX200 , em NIPT e testes infantis precoces.

Fonte: Texto extraído e traduzido do portal 360Dx

e BIORAD Brasil